蛋白标记方法需根据蛋白自身性质和标记物类型建立相应的技术方案:
1、放射性同位素标记:具有灵敏度高、特异性强、适用性广、定位准确等特点,常用的同位素包括125I、131I、32P等。同位素标记的关键在于,测定放射性强度的条件和合适的比活度。标记过程包括实验准备、标记实验及放射性废物处理等阶段。
2、荧光标记:将荧光材料与目标蛋白结合,形成荧光结合物。荧光材料包括荧光素(FITC、罗丹明、5-FAM等)、自发荧光蛋白、纳米晶体材料(量子点)等。标记方法也根据各类荧光材料的不同性质,有很大差异。
3、酶标记:常见标记用的酶分子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及葡萄糖氧化酶等。采取的偶联方法包括:戊二醛法、苯醌法、偶氮法等。
4、生物素(biotin)标记:生物素分子量小,对蛋白质自身活性影响小,重要的是,生物素与亲和素(avidin)有很高的亲和力,可以大幅度提高检测灵敏度。因此,生物素标记已成为一种常用而有效的蛋白标记技术手段。
5、其它标记方法:荧光蛋白可通过基因水平操作,将荧光蛋白基因与目的蛋白基因重组,再表达重组蛋白。纳米颗粒还可通过物理方法吸附蛋白,形成标记物。